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2×GC-rich PCR MasterMix（無染料）說明書
貨號：K0658
保存條件：-20℃長期保存。如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復凍融。
組分說明
Cat. No. K0658
Kit Size 1 ml
2×GC-rich PCR MasterMix（無染料） 1 ml
RNase-Free Water 1 ml
注意：2×GC-rich PCR MasterMix含有Es Taq DNA Polymerase,
2×Es Taq PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400 µM dNTP mix。
產(chǎn)品簡介
本品是由Es Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑
和增強劑組成的預混體系，濃度為 2×。預配好的PCR混合液使操作更加2+ 簡單快捷，可最大限度地減少人為誤差和污染。經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液配方使酶的作用發(fā)揮最大功效，實現(xiàn)對復雜模板的高保真、高效率擴增，d創(chuàng)的MasterMix配方使整個反應體系非常穩(wěn)定，重復性好。本品不含染料， PCR程序結(jié)束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進行電泳操作。擴增得到的PCR產(chǎn)物3′端附有一個“A"堿基，因此可直接用于T/A克隆。主要適用于對保真性要求較高的PCR反應和結(jié)構(gòu)復雜的模板如GC含量高，有二級結(jié)構(gòu)等的擴增，對簡單模板有效擴增的片段可達20 kb，對復雜模板可達10 kb。
質(zhì)量控制
經(jīng)檢驗無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增多種基
因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個月，活性無明顯改變。
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的
片段大小不同進行相應的改進和優(yōu)化。
1. PCR反應體系
試劑 50 μl反應體系 終濃度
2×GC-rich PCR MasterMix 25 μl 1×
Forward Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Template DNA 2 μl <1 μg/reaction
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
2. PCR反應條件
步驟 溫度 時間
預變性 94℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 25-35個循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 2 min
注意：1）一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應條件。
2）延伸時間應根據(jù)所擴增片段大小設定，Es Taq DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/30 s。
3）可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應盡量減少循環(huán)次數(shù)。
3.結(jié)果檢測：本產(chǎn)品不含染料，反應結(jié)束后取5 µl反應產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結(jié)果。
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