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大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

• 細菌分離純化：無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，伊美蘭瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)12-24h，用普通培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)；
• 細菌形態(tài)特征：無菌挑去上述純化培養(yǎng)菌，革蘭氏染色鏡檢

電鏡觀察：FQ-180菌液培養(yǎng)7h后，3000r/min離心5min，棄上清，ddH₂O洗滌2次重懸，取15ul滴在Formver膜覆蓋在銅網(wǎng)上，2min后滴加磷鎢酸負染2min，待銅網(wǎng)烘干后，在投射電子顯微鏡下觀察

• 生化試驗：將初步分離到的可疑菌落進行吲哚試驗，MR試驗，VP試驗，淀粉E試驗，枸櫞酸鈉利用試驗，乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇發(fā)酵試驗，產(chǎn)硫化氫試驗，尿素酶試驗，觸酶試驗，運動性試驗，三塘鐵斜面穿刺試驗（或用ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)和ID32E腸道菌鑒定試劑條進行生化試驗）
• 藥敏試驗：按照美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）推薦的標準K-B紙片法進行實驗操作和結果判斷（所采用的抗生素見圖1）
• 血清型鑒定：采用玻板凝集反應對分離株進行血清型鑒定，先用多因子血清通過玻板凝集試驗篩選可能的血清型，然后再與大腸桿菌單因子血清各10ul在玻板上混勻，30S內出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應，同時以菌液與0.5%碳酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象
• PCR鑒定：將分離純化后的菌株按照煮沸法制備細菌DNA模板，以大腸桿菌phoA基因的特異性引物進行PCR鑒定
• 毒力基因與耐藥性的關系：根據(jù)藥敏試驗的結果，針對藥敏性較為普遍的抗生素的耐藥基因情況，找出其規(guī)律，并研究獨立基因與耐藥性的關系，然后采用多重PCR方法檢測耐藥基因，如4種氨基糖苷類耐藥基因aadA1，aac2，aac4，aphA3；3種四環(huán)素類耐藥性基因tetA，tetC以及tetM的流行情況
• 提取DNA及16s rDNA鑒定：提取細菌基因組DNA，并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特異性引物進行擴增，后進一步對PCR擴增的DNA克隆、測序并開展序列分析
• 致病性試驗：參照A.E.Williams等方法，設置16組試驗組，1組陰性對照，實驗組每株菌攻毒4只小組，按0.2ul/只腹腔注射菌液濃度為1*10⁹ef/ml，對照組4只小鼠注射等劑量的生理鹽水，觀察發(fā)病及死亡情況，無菌采集死亡小鼠肝臟、心臟進行分離鑒定
• 雞胚致死試驗：將待測大腸桿菌分別劃板，挑去平板上的單菌落，與LB液體培養(yǎng)基中37度搖床過夜培養(yǎng)，然后離心，經(jīng)PBS洗2次，并用PBS懸液進行倍比稀釋，取0.1ml稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚大約100-300CFU/只，每組10只，同時取0.1ml稀釋液涂板，做細菌計數(shù)，對照分兩組，一組直射PBS，一組不注射，計每日死亡數(shù)，質4d，計胚胎致死率
• 病毒分離：收集病樣加入青霉素（終濃度1000U/ml）和鏈霉素（終濃度1000U/ml），于4℃作用4h以上，取0.2ul接種于9-10日齡雞胚羊膜腔，37℃培養(yǎng)72h，4℃過夜后收集羊水，每份樣品接種3枚雞胚，采集的羊水用1%雞紅細胞進行血凝試驗，判斷病毒是否成功分離，如果標本呈陽性，采用血凝抑制試驗進一步堅定，標本呈陰性則繼續(xù)自傳3代